Determinación de la actividad antidedrepanocítica de nanopartículas cargadas con vainillina mediante Resonancia Magnética Nuclear

Introducción

La Anemia Drepanocítica (AD), Drepanocitemia o Sicklemia es una enfermedad que predomina en la raza negra y se caracteriza porque los eritrocitos adquieren forma de hoz debido a la polimerización de la hemoglobina S desoxigenada (dHbS). (Nigen y Manning, 1977), (Beddell et al., 1979). Los glóbulos rojos falciformes ocluyen los vasos sanguíneos y son propensos a la hemólisis lo que induce crisis de dolor intenso, isquemias orgánicas y otras complicaciones sistémicas (Beddell et al., 1979).

Es la anemia hemolítica de carácter genético más frecuente en el mundo y está considerada como un problema de la salud pública en muchos países. En Cuba, se calcula que el número de portadores es de alrededor de 300 000, y el número de enfermos aproximadamente de 4000, para una incidencia del estado de portador del 3,08 % en la población general y del 6 % en el color de piel negra y mestiza (Morejón et al., 2019).

En la actualidad no se cuenta con un tratamiento seguro y eficaz para erradicar la AD, son varios los abordajes terapéuticos que se emplean para disminuir las crisis y aumentar la esperanza de vida de los pacientes. El empleo de la nanotecnología como herramienta para la solución de este problema de salud mediante la encapsulación de compuestos naturales como la vainillina pudiera ser una alternativa terapéutica, ya que diversos estudios han demostrado que la vainillina posee la capacidad de inhibir el proceso de polimerización de la hemoglobina S (Cabal et al., 1998).

Los nanosistemas de liberación controlada de fármacos tienen propiedades que favorecen la protección, absorción y dirección de fármacos en el organismo (Lu et al., 2014). Se fabrican a partir de materiales biocompatibles, como polímeros biodegradables y lípidos similares a los componentes de las estructuras celulares (Sahdev y Ochyl., 2014). Las nanopartículas sólidas lipídicas son estructuras similares a las lipoproteínas presentes en el organismo y estas pueden incorporar en su matriz lipídica diversas moléculas y protegerlas de reacciones de degradación que se producen en el medio biológico (Kingwell et al., 2014).

Entre las técnicas que se han empleado para el estudio del metabolismo celular se destaca la espectroscopía de resonancia magnética protónica (RM- 1H), este constituye un método no invasivo y permite medir el acortamiento del tiempo de relajación espín-espín (T2) que experimentan las moléculas de H2O de los hematíes falciformes (Fung et al., 1989). Las variaciones temporales de T2 describen la cinética de la polimerización de la HbS intracelular que consta de tres etapas (inicio, polimerización, terminación) y se explica a través del modelo de doble nucleación que consiste en: la nucleación homogénea y heterogénea, ambas coexisten y su efectividad relativa cambia a medida que trascurre proceso. (Menon et al., 1991); (Lester y Bryant 1991).

Considerando lo antes expuesto la investigación tiene como objetivo: determinar la actividad antidedrepanocítica de nanopartículas cargadas con vainillina mediante RMN.

Metodología

La investigación se desarrolló de conjunto con el Laboratorio de Hematología del Hospital Dr. Antonio María Béguez César y los Laboratorios de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Oriente de Santiago de Cuba.

Obtención y purificación de las nanopartículas

Para la obtención de las nanopartículas se utilizó el método de inyección del disolvente: 50 mg de ácido esteárico (Sigma-Adrich, St. Louis. MO. EE.UU) y 7, 9 mg (concentración requerida para obtener una relación molar hemoglobina-vainillina de 1:2) de vainillina (Sigma-Adrich) fueron disueltos en etanol (Sigma- Adrich) a 80 0C de temperatura. Esta solución fue colocada en una jeringuilla de 1 mL e inyectada rápidamente en una solución al 0,1 % del tenso activo Tween 80 (Sigma- Adrich) bajo agitación magnética (IKA - Werke, Staufen, Alemania) a 80 0C. La purificación de la suspensión inicial fue sometida a ultrafiltración utilizando filtros de membranas de 0,450 µm. Posteriormente, la solución filtrada fue sometida a centrifugación (Neofuge, Shangai, China) a una velocidad de 16000 rpm. Los precipitados fueron re-suspendidos en 1 mL PBS pH= 7.4 y almacenados a 4 oC en un refrigerador (Daewoo, Seul, Corea del Sur) (Schubert y Muller, 2003). Para este estudio, fueron preparadas además suspensiones de nanopartículas sólidas lipídicas sin vainillina y disoluciones de este aldehído en las concentraciones adecuadas para el estudio.

Determinación de la eficiencia de encapsulación

La eficiencia de encapsulación de la vainillina se calculó mediante la concentración de esta en los sobrenadantes por método espectrofotométrico, inmediatamente después de la obtención y purificación de las nanopartículas por centrifugación (Castan et al., 2012). Este valor se le restó a la cantidad de vainillina añadida inicialmente y se estimó por diferencia la magnitud de la encapsulación. El método aprovecha la presencia en la estructura de un hidroxilo fenólico y se basa en la reacción de este tipo de compuesto, en medio básico, con el reactivo de Folin Ciocalteu. Debido a esta reacción se desarrolló un color azul, el cual fue leído a 710 nm en un espectrofotómetro Rayleigh, Taijin, (China). Para la determinación de las concentraciones en las mezclas problemas se realizó una curva de calibración utilizando soluciones patrones de vainillina. El porciento encapsulado se determinó según la ecuacion: (Ecuación 1) Donde: % E = porciento de encapsulación CVi = concentración de vainillina inicial CVsn = concentración de vainillina en el sobrenadante

Estudio de la retención de la vainillina por las nanopartículas

La evaluación de la retención de la vainillina en las nanopartículas se realizó según la metodología propuesta por Castan et al., (2012).

Preparación de las Grupos experimentales

Las muestras biológicas (sangre total de pacientes con AD con hemoglobina SS (SS)) fueron suministradas por el banco de sangre del Hospital Dr. Antonio María Béguez César. Se diseñaron cuatro grupos experimentales y se replicaron tres veces cada una. Grupo 1 (G1): 300 µl de sangre total SS y depositándose en un ámpula de RMN para posterior medición.

Grupo 2 (G2): 150 µl de sangre total SS y 150 µl de formulación de NSL con vainillina y se mezclaron en el ámpula de RMN. Grupo 3 (G3): 150 µl de sangre total SS y 150 µl de formulación de vainillina y se mezclaron en el ámpula de RMN. Grupo 4 (G4): 150 µl de sangre total SS y 150 µl de formulación de NSL y se mezclaron en el ámpula de RMN. Las ámpulas fueron selladas con parafilm para asegurar las condiciones anoxigénicas.

Las muestras preparadas fueron medidas en un Relaxómetro GIROMAG 04 (Cuba). Para ello, se utilizaron en todos los grupos experimentales los parámetros provenientes un estándar biológico (para calibración del relaxómetro) relativos al tiempo de demora (Td)

valor y parámetros anatomofisiológicos (pO2 en sangre, pH, concentración de HbS y de HbF) (Fung et al., 1989).

La determinación de la concentración, clasificación, estudio de la cinética de polimerización de la HbS y el comportamiento temporal de T2 se realizaron a la frecuencia de 4,4 MHz con la serie de impulsos 90º-τ-180º según expuesto por Menon et al., (1991) y Lester y Bryant, (1991). Otras condiciones experimentales fueron: 16 promediaciones, 150 pulsos, un tiempo de repetición (TR)= 50000000 min y un Tau=3000.

Procesamiento estadístico

Las mediciones de RMN realizadas en el Relaxómetro GIROMAG 04 se ajustaron utilizando el programa Microsoft Excel 2010. Los datos fueron procesados utilizando el software STATISTICA 8.1 para Windows para la comparación de medias entre grupos experimentales a través del empleo del estadígrafo T-student. Se consideró un 95% de confianza.

Resultados y discusión

Determinación de la eficiencia de encapsulación e influencia de la concentración de ácido esteárico en la estabilidad de las nanopartículas.

Se obtuvieron nanopartículas sólidas lipídicas con valores de eficiencia de encapsulación superiores al 50%, lo que demuestra una adecuada incorporación de vainillina en estos nanosistemas.

La Figura 1, muestra que la concentración de ácido esteárico no influye significativamente (según el test estadístico aplicado y con un 95% de confianza) en la capacidad de retención de la vainillina en las nanopartículas. Ello puede estar relacionado con la liposolubilidad de la vainillina. Este resultado coincide con lo publicado en el 2012 por Castan y colaboradores en donde plantean la eficacia de los liposomas de vainillina dada su capacidad de mantenerse suspendidos en soluciones acuosas y así garantizar su transporte en la sangre (Castan et al., 2012).

Figura 1.
Representación de la capacidad de retención de las nanopartículas para concentraciones de ácido esteárico. Fuente: Elaborado por los autores.

Estudio de la retención de la vainillina por las nanopartículas

Durante el estudio los valores de Td obtenidos fueron los siguientes valores medios: 120 min para G1, 270 min para G2 y 90 min para los grupos G3 y G4, observándose similitud para los grupos G3 y G4. Ello es una muestra del incremento significativo para el tratamiento con nanopartículas sólidas lipídicas cargadas con vainillina (NSL-V).

Figura 2.
Grupo 1 (Sangre total SS)

Figura 3.
Grupo 2 (Sangre SS + NSLV)

Figura 4.
Grupo 3 (Sangre SS + vainillina)

Figura 5.
Grupo 4 (Sangre SS + NSL) Fuente: Elaborado por los autores.

La formulación correspondiente al grupo experimental, G1 (300 µl de sangre total SS) describió la curva sigmoidea característica de los procesos de polimerización que ocurren en los pacientes con AD (Figura 2). El aumento de los valores del T2 y el alargamiento del Td de la polimerización es una consecuencia de la movilidad de las moléculas de agua por inhibición del polímero (Strader et al., 2019), (Maruyama et al., 2020).

El grupo experimental G2 (150 µl de sangre total SS y 150 µl de formulación de NSL con vainillina muestra el mayor Td (Figura 3). Esto puede estar condicionado a que las altas concentraciones intracelulares de vainillina establezcan un equilibrio entre las moléculas de esta sustancia libres en el medio y las enlazadas a la HbS. Esto podría explicar el efecto retardador lo que sugiere una saturación de los sitios de unión entre Hb - vainillina y una mayor efectividad en la ralentización del proceso de polimerización (Wood et al., 2014), (Deshpande et al., 2018), (Gour et al., 2020). Los grupos experimentales G3 (150 µl de sangre total SS y 150 µl de formulación de NSL) y G4 (150 µl de sangre total SS y 150 µl de formulación de NSL) representados por las figuras 4 y 5 respectivamente mostraron iguales valores de Td, a pesar de ser formulaciones diferentes. Esto puede deberse a que las moléculas de vainillina en el torrente sanguíneo interaccionan con otros componentes del tejido sangre en vez de atravesar la membrana celular de los eritrocitos, la cual supone una barrera importante para muchos fármacos (Chen et al., 2017).

Al comprar los resultados obtenidos con los reportados por García et al., (2005), y Torres et al., (2005) se observó que los tiempos de demora fueron mucho menores. Esta diferencia puede estar relacionada a dos factores: la influencia de la membrana en la señal de RMN, y la presencia en sangre de moléculas moduladoras de la afinidad de la Hb por el oxígeno, como es el caso del 2,3 bifosfoglicerato (2, 3 BPG) (Sarkar et al., 2017). La membrana celular de los eritrocitos influye en la magnitud de los tiempos de demora. Factores como la permeabilidad de la membrana celular pueden influir en la movilidad del agua, ya que las membranas biológicas son semipermeables y pueden regular la entrada y salida de diversas sustancias. En el caso de los eritrocitos con HbS, se ha comprobado que estos pueden presentar alteraciones en la permeabilidad, lo que afecta el movimiento de las moléculas de agua. Las alteraciones presentes en las membranas de los eritrocitos falciformes pueden traer como consecuencia una deshidratación rápida y severa de los glóbulos rojos (Gallagher, 2017).

Estos cambios en el contenido de agua pueden afectar los valores de Td en sangre total al ser comparados con soluciones de HbS, en donde la movilidad de las moléculas de agua no depende de la permeabilidad de las membranas biológicas. Como consecuencia de lo anterior, puede asumirse que en el caso de los eritrocitos SS, la elevada tasa de polimerización de la HbS y la rápida deshidratación provoca un aumento del movimiento de las moléculas de agua causando que todo el proceso seguido por RMN se registre en menos tiempo, por lo que la curva se desplaza hacia la izquierda y el Td disminuye (Brugnara, 2018).

El segundo factor que debe ser considerado es la concentración de agentes moduladores de la afinidad de la Hb por el oxígeno como el 2, 3 BPG. Esta molécula es capaz de unirse a la Hb y disminuir la afinidad de esta por el oxígeno. Fisiológicamente el 2, 3 BPG permite que el oxígeno sea liberado hacia los tejidos, ya que de lo contrario este permanecería retenido en las moléculas de Hb. El 2,3- BPG se enlaza al centro del tetrámero de Hb, en un ‘bolsillo’ que sólo está presente en el estado tenso o de menor afinidad por el oxígeno de esta molécula (T). En la transición de la molécula T al estado relajado o estado de mayor afinidad por el oxígeno (R), se libera el 2,3- BPG por colapso del ‘bolsillo’. La ruptura de los enlaces entre la hemoglobina y el 2,3- BPG provocará que se cambie del estado T al R, condicionando el incremento del número de enlaces de oxígeno con la hemoglobina. Es por ello que la hemoglobina se mantiene en su estado T hasta que un medio con altas concentraciones de oxígeno condicione su cambio. Esta propiedad del 2,3- BPG es conocida como efecto alostérico, que no es más que la “regulación” de la unión de las moléculas de oxígeno con la hemoglobina desde su unión a un sitio estructuralmente diferente al del O2 (Nelson y Cox, 2019), (Ghysels et al., 2019).

Se ha demostrado que en un estado puro la hemoglobina se enlaza fuertemente al oxígeno, dificultando su liberación, mientras que en las células rojas su afinidad es menor. Esta diferencia se debe a la presencia del 2,3- BPG en las células rojas de la sangre a una concentración elevada, mientras que en la hemoglobina purificada o en solución, la concentración es baja. Al existir bajas concentraciones de 2,3- BPG en las soluciones de HbS, las curvas sigmoideas resultantes de los experimentos donde están presentes estas soluciones deben estar desplazadas hacia la derecha, lo que demuestra una mayor afinidad por el oxígeno en dichos casos. Lo anterior conlleva a que todo el proceso seguido por RMN sea más lento y se obtengan mayores valores de Td, en comparación con la sangre total, en donde la concentración de 2, 3 BPG es mucho mayor (Oslund et al., 2017).

El hecho de que la vainillina en nanopartículas haya resultado superior en retardar la polimerización, corrobora lo que ha sido demostrado en otros estudios con nanopartículas para el aumento de la penetración intracelular de moléculas activas biológicamente (García et al., 2005). La presente investigación aporta un dato relevante sobre el comportamiento de la vainillina en sangre total, al demostrar que su capacidad de inhibir la polimerización de la HbS.

Conclusiones

Se obtuvieron nanopartículas sólidas lipídicas con valores de eficiencia de encapsulación superiores al 50%, lo que demuestra una adecuada incorporación de vainillina en estos nanosistemas. Mediante el empleo de la técnica RMN se demostró que la vainillina encapsulada en NSL aumenta los valores de Td, lo que es indicativo de la inhibición de la formación de los polímeros de HbS.